Национальный производитель
иммунобиологических препаратов в России
24 ноября 2017 года, 10:24 (МСК)

Комплект № 2. ИФА ТС АГ ВКЭ Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита.

Медицинские изделия для диагностики IN VITRO
Срок годности
1 год.
Производитель
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России; Россия, 634040, Томская область, г. Томск, ул. Ивановского, д. 8.

Описание
Принцип метода заключается во взаимодействии антигена (АГ) ВКЭ, содержащегося в исследуемых образцах (клещах и др. материалах), с иммуноглобулином класса G против ВКЭ, сорбированным в лунках полистиролового планшета. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело» выявляют с помощью конъюгата - иммуноглобулина класса G против ВКЭ, конъюгированного с пероксидазой хрена.
Форма выпуска
ИГ – 1 ампула, 0,5 мл; Конъюгат (концентрат) – 1 ампула, 0,3 мл; КА+ – 1 ампула, 0,3 мл; КА– – 1 ампула, 0,3 мл; КББ – 1 флакон, 10 мл; ФСБ-Т×25 – 1 фл., 20 мл; РР – 3 фл. по 20 мл; ЦБР – 1 фл., 12 мл; ТМБ концентрат – 1 фл., 3 мл; Стоп-реагент – 1 фл., 6 мл; Планшет 96 луночный для ИФА разборный – 1 шт. В коробку с набором вкладывают инструкцию по применению и нож или скарификатор ампульный (при упаковке ампул, не имеющих кольца излома или точки для вскрытия).
Состав
Набор реагентов ИФА ТС АГ ВКЭ Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита (Комплект № 2)  включает следующие реагенты для проведения прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА):
ИГ - иммуносорбент – иммуноглобулин класса G (крысиный) против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабоопалесцирующая бесцветная жидкость.
КА+ - контрольный положительный образец – антиген ВКЭ, экстрагированный из ткани мозга мышей, инфицированных ВКЭ, инактивированный бетапропиолактоном, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесци-рующая светло-желтого цвета жидкость.
КА– - контрольный отрицательный образец – антиген из ткани мозга неинфицированных мышей, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая светло-желтого цвета жидкость.
Конъюгат (концентрат)  – иммуноглобулин класса G против ВКЭ (крысиный), конъ-югированный с пероксидазой хрена, аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость.
КББ - карбонатно-бикарбонатный буферный раствор для разведения ИГ – бесцветная прозрачная жидкость.
ФСБ-Т×25 – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином,  раствор для разведения образцов и промывания планшетов – прозрачная или слабо опалес-цирующая бесцветная жидкость, в которой допускается выпадение кристаллов белого цве-та, растворимых за 20-30 мин при температуре 37 ºС.
РР - раствор для разведения конъюгата, КА+, КА– и исследуемых образцов – опалес-цирующая бесцветная жидкость, допускается образование осадка белого цвета.
ЦБР - буферный раствор с перекисью водорода – раствор для разведения ТМБ – про-зрачная бесцветная жидкость.
ТМБ - концентрат тетраметилбензидина – хромоген – прозрачная бесцветная жид-кость.
Стоп-реагент – прозрачная бесцветная жидкость.
Планшет полистироловый 96-луночный разборный для ИФА.

Комплект № 2 рассчитан на проведение 96 определений, включая контрольные. 
Показания для применения
Набор реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ» Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита предназначен для выявления ВКЭ или его антигенов в суспензиях переносчиков (клещей), в крови людей, в крови и суспензиях органов инфицированных лабораторных животных, в культуральной жидкости инфицированных клеточных культур.

Режим дозирования и способ применения
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование, материалы и реагенты (не включенные в  состав набора), необ-ходимые для проведения анализа:
- термостат, поддерживающий температуру (37±1) ºС; 
- холодильник бытовой;
- промыватель для микропланшет, ручной или полуавтоматический;
- дозаторы (пипетки) переменного объема (механические или электронные): 8- или 
12-канальные с объемом дозирования от 50 до 300 мкл и 1- канальные с объемом до-зирования от 10 до 100 мкл, от 100 до 1000 мкл и от 500 до 5000 мкл;
- наконечники для дозаторов соответствующей вместимости;
- шейкер (встряхиватель лабораторный медицинский V-3 типа вортекс); 
- часы;
- бумага фильтровальная;
- перчатки резиновые хирургические;
- стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 50 мл и 500 мл;
- цилиндры мерные вместимостью 25 мл, 100 мл, 500 мл;
- вода дистиллированная  или вода очищенная.
Вся посуда, используемая для постановки реакции, должна быть химически чистой и не содержать ионов тяжелых металлов. Следует избегать непосредственной близости с хлорсодержащими дезинфектантами, особенно на этапах приготовления ТМБ. Для отбора исследуемых образцов и реагентов тест-системы необходимо использовать автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5 %. Отбор реагентов следует произ-водить чистыми наконечниками для автоматических пипеток. 

Подготовка исследуемого материала.
Обработка клещей
Для испытания в ИФА пригодны лишь неповрежденные клещи. Клещей однократно промывают 70 % спиртом этиловым и 2-3 раза 0,9 % раствором натрия хлорида. Каждого клеща помещают в пробирку для микропроб вместимостью 0,5-1,5 мл, маркируют и хранят до исследования при температуре не выше минус 20 ºС не более 2 недель. Перед испытани-ем в ИФА готовят 10 % суспензию клеща: его растирают металлическим стержнем в той же пробирке, добавляют 0,2 мл РР. Клеща, насосавшегося крови, растирают, добавляя РР в количестве, равном его объёму. Для ИФА берут 0,1 мл суспензии, остаток пробы хранят в той же пробирке и тех же условиях, что и клещей не более 2 недель.

Подготовка крови
Кровь забирают из вены шприцем в количестве 2-5 мл, переносят в стерильную про-бирку, выдерживают 30-50 мин при температуре 37 оС или 1-2 ч при температуре 18-25 ºС для образования сгустка, затем центрифугируют 15-20 мин при 1500-2000 об/мин. Сыво-ротку отсасывают и помещают в стерильную пробирку, сгусток крови растирают в асепти-ческих условиях, добавляя равное ему по объёму количество РР. Затем центрифугируют при том же режиме, что и кровь. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробир-ку.
Приготовленные пробы маркируют и хранят до исследования при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 недели или при температуре не выше минус 20 ºС не более 3 мес. В зависимости от цели исследования  в ИФА могут быть испытаны как неразведенные пробы сывороток и сгустков крови, так  и в разведениях (например, от 1:2 до 1:8).

Подготовка мозговой суспензии
Для исследования мозга инфицированных животных (или мозговой ткани людей, взятой в случае летального исхода) необходимо приготовить 1 % мозговую суспензию на РР. Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и хранят до исследования  также как пробы крови. В ИФА проверяют как неразведенную суспензию, так и в разведении 1:10 и выше. 

Подготовка культуральной жидкости
Культуральную жидкость зараженных клеточных культур перед испытанием в ИФА освобождают от клеток центрифугированием при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин. В ИФА исследуют как неразведенные пробы, так и в разведении 1:2 и более.

Подготовка растворов и реагентов (для проведения анализа на одном планшете).
Набор перед использованием необходимо выдержать не менее 30 мин при температу-ре от 18 до 25 °C. 

Иммуносорбент (ИГ).
Рабочее разведение ИГ указано на ампуле (например, 1:20). 
Содержимое ампулы с ИГ растворяют в 0,5 мл воды очищенной или дистиллирован-ной (далее воды) (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем разводят в КББ до разведения, указанного на ампуле (например: 1:20 – 0,5 мл ИГ и 9,5 мл КББ).

Раствор для промывания планшетов (ФСБ-Т).
Необходимое количество концентрата ФСБ-Т×25 (в зависимости от количества стри-пов) разводят в 25 раз водой (см. таблицу 1). В случае выпадения осадка концентрат 
ФСБ-Т×25 предварительно прогревают 20-30 мин при температуре 37 ºС до полного раство-рения осадка.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т×25 хранят при температуре от 2 до 
8 ºС не более 2 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут.

Подготовка контрольных образцов.
Содержимое ампул с КА+ и КА– растворяют в 0,3 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем готовят из них рабочее разведение каждого контрольного образца в РР так, как указано на ампуле (например: 1:200 – 0,01 мл антигена и 2 мл РР).
Хранение: неиспользованные растворенные контрольные образцы хранят при темпе-ратуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 
14 сут (рекомендуется разлить на аликвоты в микропробирки для исключения повторного замораживания-оттаивания).

Рабочее разведение конъюгата.
Содержимое ампулы с конъюгатом растворяют в 0,3 мл воды (время растворения 
1,5 мин при температуре 20-25 ºС). Необходимое количество конъюгата (в зависимости от количества используемых стрипов) разводят РР до разведения, указанного на ампуле. Тщательно перемешивают. Рабочее разведение конъюгата готовят не ранее чем за 30 мин до использования.
Хранение: неиспользованный растворенный конъюгат хранят так же, как контроль-ные образцы. 

Рабочий раствор ТМБ. 
Рабочий раствор хромогена готовят непосредственно перед использованием, соединяя концентрат ТМБ с ЦБР в соотношении 1:5, тщательно перемешивают. Смесь готовят в чистой посуде, избегая контакта раствора с металлом, воздействия интенсивного источника света и близости с хлорсодержащими веществами. 

Хранение: смесь хранят при температуре 18-25 ºС не более 15 мин в защищенном от света месте. Неиспользованные ТМБ и ЦБР хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более  14 сут.

Внимание! Посуду и наконечники пипеток, контактирующие с раствором ТМБ нель-зя отмывать с применением синтетических моющих средств, поскольку даже их следы ве-дут к разложению ТМБ в ходе реакции (лучше всего готовить раствор субстрата в специ-ально выделенной промаркированной посуде).

Проведение иммуноферментного анализа
Сорбция ИГ на планшете.
В лунки планшета, кроме лунок 4А, 8А и 12А, вносят по 100 мкл раствора ИГ. Лунки 4А, 8А, 12А используют для выведения фотометра на нулевую отметку («бланк»), в нее вносят по 100 мкл РР на всех этапах, кроме последнего, на котором вносят раствор хромо-гена). 
Планшет закрывают крышкой и помещают при температуре от 2 до 8 ºС на 18-20 ч или при температуре (37±1) ºС на 2,0-2,5 ч.
По окончании инкубации содержимое лунок удаляют в сосуд для дезинфекции сли-вов. Планшет промывают раствором ФСБ-Т два-три раза при помощи автоматического или ручного промывающего устройства, внося в каждую лунку не менее 300 мкл раствора, с последующим удалением жидкости через 3-5 мин экспозиции. По окончании промывки лунки тщательно осушают, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколь-ко слоев фильтровальной бумаге (фильтровальную бумагу для осушения планшетов меняют на каждом этапе ИФА). 
Внимание! Планшет, сенсибилизированный ИГ (не использованные стрипы) можно хранить в закрытых полиэтиленовых пакетах при температуре не выше минус 10 ºС не бо-лее 14 сут, перед использованием однократно отмывают.

Внесение контрольных и исследуемых образцов.
Независимо от количества стрипов, используемых для постановки анализа, рекомен-дуется следующая схема внесения контрольных образцов: в три лунки вносят КА– (в рабо-чем разведении), в одну лунку – КА+ (в рабочем разведении), одну лунку используют для контроля конъюгата: на данном этапе в нее вносят раствор РР. Одну лунку используют для контроля поглощения раствора ТМБ («бланк»), в нее вносят по 100 мкл раствора РР на всех этапах, кроме последнего, на котором вносят раствор хромогена.
В остальные лунки стрипов (кроме «бланка») вносят по 100 мкл исследуемых образ-цов. Стрипы закрывают и помещают на 1-2 ч при температуре (37±1) ºС или на 18-25 ч при температуре от 2 до 8 ºС, после чего их промывают.

Внесение конъюгата.
В каждую лунку стрипов, кроме «бланка», вносят по 100 мкл приготовленного раствора конъюгата. Планшет закрывают и помещают на 45-60 мин при температуре (37±1) ºС, затем отмывают 5 раз, остатки влаги удаляют.

Внесение хромогена и стоп-реагента.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл приготовленного хромогена. Стрипы выдерживают в защищенном от света месте при температуре 18-25 ºС в течение 5-7 мин до появления интенсивного голубого окрашивания в лунке с КА+, после чего в лунки вносят по 50 мкл стоп-реагента.

Учет результатов.
Регистрацию результатов иммуноферментного анализа проводят на фотометрах для ИФА по оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм. Прибор выводят на нуле-вую отметку, используя «бланк».
Результаты учитывают после изменения цвета окрашивания с голубого на желтый, но не позднее чем через 7 мин после остановки реакции. 
Реакцию учитывают, если значение ОП в лунках контроля конъюгата  и с КА–  не превышает 0,1.
Для интерпретации результатов ИФА вводится «пороговая» величина (ОПпор), кото-рая исчисляется следующим образом: подсчитывается среднее арифметическое значение ОП в лунках с  КА–, если среднее арифметическое значение ОП КА– выше 0,045, то «поро-говая» величина вычисляется умножением средней арифметической на 2,1; если среднее арифметическое значение ОП КА–  ниже 0,045, то «пороговая» величина равна сумме ОП средней и поправочного коэффициента 0,05.
Если показатель ОП КА–  в одной из трёх лунок значительно отличается от других 
в 1,5 и более раза, его из подсчета исключают.
Положительной считают пробу, ОП которой выше «пороговой» величины. 
Проба КА+ в разведении 1:200 должна быть положительной.
Меры предосторожности при применении
Набор реагентов специфически безопасен (не содержит материалов, которые могут инфицировать персонал во время анализа). Однако при работе с исследуемым материалом следует соблюдать санитарные правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности» (Госсанэпиднадзор России, Москва, 2003 г.):
- работать в резиновых перчатках;
- использовать автоматические пипетки (дозаторы) с одноразовыми пластиковыми нако-нечниками;
- все использованные материалы, сточные растворы, одноразовую лабораторную посуду перед утилизацией подвергать обработке дезинфицирующим раствором (например,  6 % раствор перекиси водорода или 3 % раствор хлорамина) в течение 24 ч при соотноше-нии объемов обеззараживаемого материала и дезраствора 1:2 или кипячением в течение 30 мин или автоклавированием при давлении пара 0,2 МПа и температуре (132±1) ºС в те-чение 45 мин; 
 - оборудование, находившееся в контакте с исследуемыми образцами, дезинфицировать 70 % этиловым спиртом.
При попадании на кожу стоп-реагента или ТМБ следует немедленно смыть их обиль-ным количеством воды и вымыть с мылом место контакта.