Национальный производитель
иммунобиологических препаратов в России
24 ноября 2017 года, 10:32 (МСК)

Моно-РИД-каппа, лямбда Сыворотки диагностические моноспецифические против κ (каппа) и λ (лямбда) цепей иммуноглобулинов человека сухие

Медицинские изделия для диагностики IN VITRO
Срок годности
3 года.
Производитель
ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России:Россия, 603950, Нижегородская область, г. Нижний Новгород, ул. Грузинская, 44

Описание
Сыворотки диагностические моноспецифические против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека представляют собой лиофилизаты иммунных сывороток крови овец, содержащих антитела против κ- или λ-цепей иммуноглобулинов.
Форма выпуска
Выпускается в ампулах объемом 1 мл.
Состав
Набор состоит из 2 компонентов. 

Сыворотка против κ-цепей иммуноглобулинов человека Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. 1 ампула (флакон), 1 мл.
Сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов человека Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. 1 ампула (флакон), 1 мл.
Показания для применения
Предназначен для качественного определения типа легких цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови и свободных легких цепей (белков Бенс-Джонса) в моче человека методами иммуноэлектрофореза (ИЭФ), преципитации в геле и для определения их соотношения в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле.
Моноспецифические сыворотки против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов позволяют выявлять κ- и λ-цепи как в свободном виде, так и в составе целых молекул иммуноглобулинов.
Моноспецифические сыворотки против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека в ИЭФ должны выявлять с нормальной сывороткой крови человека только одну линию преципитации, соответствующую IgG человека, образовывать с раствором белков Бенс-Джонса  соответствующего типа одну линию преципитации и не образовывать линий преципитации с раствором белков Бенс-Джонса  другого типа; в РИД должны образовывать с нормальной сывороткой крови человека одно четкое кольцо преципитации в разведении сыворотки не менее, чем 1 : 8 (титр).
Сыворотки должны растворяться в течение 5 мин после добавления 1,0 мл воды очищенной. После растворения сыворотки должны быть прозрачными, без осадка и посторонних включений, розовато-желтого цвета. Допустима небольшая опалесценция в проходящем свете.

Режим дозирования и способ применения
Анализируемые образцы хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 7 суток или при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Замороженные образцы перед исследованием следует разморозить и тщательно перемешать встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. 

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ).
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с моноспецифическими сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.

Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л); 
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.

Приготовление  агарового геля  1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей. 

Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90 ± 120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застыва¬ния агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев. 
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.

Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора нормальной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).  
11.png

Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенные моноспецифические сыворотки против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать при температуре (5±3) °С в течение 24 ч. 

Учет результатов. 
После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.
Учет результатов проводить визуально. Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б.
Типирование белков Бенс-Джонса проводить в ИЭФ с сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов: с одной сывороткой образуется четкая линия преципитации, а с другой сывороткой линии преципитации не образуются.

а. а.png

б. б.png

Типирование белка Бенс-Джонса.

В лунках – раствор белка Бенс-Джонса, в канавках: а – сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов, б – сыворотка против κ-цепей иммуноглобулинов.

Типирование миеломных иммуноглобулинов следует проводить в ИЭФ с сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов и с моноспецифическими сыворотками против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) человека.
Ig-миелома определяется по образованию линии преципитации с характерной миеломной конфигурацией (утолщение в определенном участке линии) с одной из сывороток против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) и аналогичной по форме линии с одной из сывороток против κ- или λ-цепи. 
                   
а.а1.png
б.б1 - копия.png
в.в1.png 
Типирование Ig-миеломы.

В лунках – исследуемая сыворотка крови человека, в канавках: а – сыворотка против κ-цепей иммуноглобулинов, б – сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов, в – сыворотка против IgG(H).

При не выявлении линий преципитации миеломной конфигурации с сыворотками против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) рекомендуется провести в образцах количественное определение IgD и IgE.

Реакция преципитации в геле (по Оухтерлони).
Приготовление агарового геля 1 %.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 100 мл воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлорида, 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.

Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90±120) мм. Расплавленный и охлажденный  до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания на агаре с помощью специального штампа вырезать лунки и удалить из них агар. 
12.png

В центральную лунку внести с помощью пипеточного дозатора растворенную моноспецифическую сыворотку, а в лунки, расположенные по окружности – анализируемые образцы (моча миеломных больных, растворы, выделенных из нее белков Бенс-Джонса). 
После внесения образцов пластины поместить во влажную камеру и выдержать при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.

Учет результатов. 
После инкубации в агаровом геле между лунками  при наличии соответствующих антигенов и антител образуются линии преципитации.
Если анализируемый образец образует линию преципитации с сывороткой против κ-цепи и не образует ее с сывороткой против λ-цепи, то в ней присутствует белок Бенс-Джонса κ-типа. При противоположном результате – в анализируемом образце присутствует белок Бенс-Джонса λ-типа.

Радиальная иммунодиффузия (РИД) (по Манчини).
Принцип метода заключается в том, что антиген, внесенный в лунки агарового геля, содержащего моноспецифическую сыворотку к этому антигену, диффундирует в гель и, взаимодействуя с антителами сыворотки, образует кольцо преципитации. После инкубации устанавливается линейная зависимость между логарифмом концентрации антигена и диаметром кольца преципитации в определенном диапазоне концентраций.

Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерный стакан на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.

Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать. 

Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.

Приготовление агарового геля 2 %.
2 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и затем варить на кипящей водяной бане в 0,1 л воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлористого, затем 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Агаровый гель разлить в пробирки по 6-8 мл, три из которых поставить в водяную баню с температурой (53±3) °С. 

Приготовить последовательные разведения контрольной сыворотки крови человека натрия хлорида раствором 0,9 % в 2 и 4 раза.

На обезжиренную стеклянную пластину, покрытую тонкой агаровой пленкой, поместить П-образную рамку, накрыть второй пластиной, смазанной гидрофобной жидкостью, и скрепить зажимами.

Растворенные моноспецифические сыворотки развести натрия хлорида раствором 0,9 % до концентрации, в два раза превышающий титр, указанный на ампуле (например, при указанном титре 1 : 10 сыворотку следует развести в 5 раз), чтобы потом при смешивании в равных количествах с растопленным агаровым гелем получилось заявленное разведение. 
Пробирки с разведенными сыворотками промаркировать и поставить для прогрева в водяную баню с температурой (53±3) °С в течение 20-30 мин. 

Агаровый гель 2 % тщательно смешать с равным объемом разведенной моноспецифической сыворотки. Полученную смесь с помощью стеклянной пипетки залить в пространство между стеклянными пластинами. Пластины промаркировать по содержащейся в агаре сыворотке и поместить на 15-20 мин.
Таким образом приготовить пластину и для второй сыворотки. 

После застывания агара снять зажимы, верхнее стекло и рамку. В слое агара прорезать пробойником несколько рядов лунок диаметром 2-3 мм на расстоянии 15 мм от другого и агар из них удалить.


 С помощью микрошприца внести в лунки по 2 мкл нормальную сыворотку крови человека (неразведенную и в разведениях в 2 и 4 раза) и анализируемые образцы.
Затем пластины поместить во влажную камеру и инкубировать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
13.png

Учет результатов. 
После инкубации в агаровом геле образуются кольца преципитации. 
Во многих случаях измерять диаметры колец преципитации можно на влажном агаровом геле. Измерение проводить с помощью окулярного микрометра, который прикладывают к обратной стороне пластин.
Пластины также можно окрашивать. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку. 
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить. 
На высушенных пластинах измерять диаметры колец преципитации с помощью специальной линейки (например, линейки «Берингверке») с точностью до 0,1 мм. 
Концентрацию иммуноглобулинов κ- и λ-типа (в процентах) определяют по калибровочной кривой, выражающей зависимость между уровнем иммуноглобулинов определенного типа и диаметром колец преципитации (для данной пластины). Для построения калибровочных кривых используют полулогарифмическую бумагу, где на оси ординат откладывают концентрацию иммуноглобулинов κ- или λ-типа в нормальной сыворотке (неразведенная сыворотка – 100 %), а на оси абсцисс – величины диаметров колец преципитации (в мм). Образовавшиеся точки соединяют прямой линией. Таким образом строят графики для иммуноглобулинов κ- или λ-типа в отдельности. Во избежание ошибок наклон этой линии желательно иметь 40°-50°. Зная диаметр колец в исследуемых препаратах, полученных на этой же пластине, по калибровочной линии определяют концентрацию в них иммуноглобулинов данного типа в процентах. 
В случае, когда диаметр кольца преципитации исследуемого образца превышает значение диаметра кольца преципитации в неразведенной нормальной сыворотке крови человека, образец следует развести натрия хлорида раствором     0,9 % и повторить определение. Полученный результат умножить на величину разведения. 
Для оценки уровня иммуноглобулинов κ- и λ-типов в норме и патологии существенным является не их абсолютный уровень, а соотношение κ / λ, которое в норме является величиной стабильной и изменяется лишь при некоторых патологиях.
Соотношение полученных значений в процентах для сывороток здоровых людей находится в диапазоне индивидуальной вариабельности 1,0 ± 0,25.
Определение абсолютного уровня иммуноглобулинов κ- и λ-типов можно проводить лишь по отношению к стандартному образцу с известным содержанием иммуноглобулинов κ- и λ-типа. 
Среднее содержание иммуноглобулинов κ-типа в норме составляет 9,75 мг/мл, а иммуноглобулинов λ-типа – 5,0 мг/мг, а их соотношение находится в диапазоне от 1,8 до 2,0 («Иммунохимическая диагностика гаммапатий. Методические рекомендации», М., 1984). 

Меры предосторожности при применении
Все компоненты набора нетоксичны. Исследуемые образцы могут быть потенциально опасны. При работе следует использовать средства индивидуальной защиты, а образцы и использованные материалы после проведения анализа обеззараживать раствором перекиси водорода 6 % или раствором хлорамина Б 3 % в течение 2 ч.