Способ применения
Разведения всех ингредиентов реакции готовят на 0,9 % растворе натрия хлорида рН (7,0±0,2). В день постановки РНГА антиген растворяют в объеме, указанном на этикетке ампулы (10 мл). Время растворения не превышает 2 мин, растворенный препарат представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость.
Приготовление 1 % взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном.
К 4 мл растворенного антигена добавляют 0,1 мл осадка эритроцитов барана, трижды отмытых 0,9 % раствором натрия хлорида, тщательно перемешивают встряхиванием и выдерживают 1 час в термостате при температуре (37±1) ºС, повторяя встряхивание каждые 10 – 15 минут. Смесь центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин и полностью удаляют надосадочную жидкость. К осадку добавляют 10 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.
Подготовка исследуемой сыворотки.
1. Инактивирование сыворотки: нативную сыворотку выдерживают в водяной бане при температуре 56 ºС в течение 30 мин.
2. Адсорбция гетерогенных гемагглютининов: в центрифужную пробирку наливают 0,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и 0,1 мл исследуемой сыворотки; добавляют 0,05 мл отмытого осадка эритроцитов барана; смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 – 20 минут, периодически встряхивая; центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (разведение сыворотки 1:10) используют для приготовления дальнейших разведений.
3. Приготовление начального разведения сыворотки 1:125 к 11,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавляют 1,0 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:10.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
РНГА ставится в лунках стандартного полистеролового планшета в объеме 0,5 мл. В лунки наливают по 0,4 мл двукратно разведенной (0,9 % раствором натрия хлорида) исследуемой сыворотки от 1:125 до 1:64000. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1 % взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном.
Реакцию сопровождают контролем:
- на отсутствие гетерогенных гемагглютининов в исследуемой сыворотке: к 0,4 мл сыворотки в разведении 1:125 добавляют 0,1 мл 1 % взвеси эритроцитов барана, не сенсибилизированных антигеном (для получения такой взвеси к 0,1 мл осадка трижды отмытых эритроцитов барана добавляют 9,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида);
- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном: к 0,4 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавляют 0,1 мл 1 % взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном;
- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов барана, не сенсибилизированных антигеном: к 0,4 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавляют 0,1 мл 1 % взвеси эритроцитов барана, не сенсибилизированных антигеном;
- специфической активности антигена: содержимое одной ампулы диагностической сыворотки разводят в 12,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая разведение 1:125; к 0,4 мл двукратных разведений диагностической сыворотки (от 1:125 до одного-двух разведений, превышающих ее титр, указанный на этикетке ампулы), добавляют по 0,1 мл 1 % взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном.
Содержимое лунок перемешивают интенсивным покачиванием до получения гомогенной взвеси и оставляют на 18 часов при температуре (20±2) ºС.
РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проводят визуально по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительной реакции на дне лунки образуется широкий зернистый осадок из склеившихся эритроцитов в виде перевернутого зонтика.
При отрицательной реакции эритроциты оседают на дне лунки в виде маленького диска с ровными краями или кольца с гладким краем.
Результаты реакции считают достоверными при следующих условиях:
- испытуемая сыворотка не агглютинирует эритроциты барана, не сенсибилизированные антигеном;
- отсутствует спонтанная агглютинация эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном и не сенсибилизированных антигеном;
Диагностическая сыворотка агглютинирует эритроциты барана, сенсибилизированные антигеном, до ее титра, указанного на этикетке.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
При заболевании сыпным тифом РНГА становится положительной при разведении сыворотки 1:125 – 1:250 на 5 – 7 день болезни, нарастание титра до 1:1000 – 1:64000 наблюдается на второй неделе заболевания. В связи с этим рекомендуется исследовать парные сыворотки, полученные на 5 – 7 и 12 – 15 дни заболевания.
Диагностическим титром исследуемой сыворотки при однократном исследовании является положительная реакция с разведения 1:1000.
Меры предосторожности при применении
Класс потенциального риска применения набора – 2 б.
Входящие в состав набора компоненты инактивированны. Однако, исследуемые материалы, а также сточные растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ними в контакте, представляют собой потенциально инфекционный материал, и обращаться с ним следует осторожно, соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности» ;
СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)»:
- работать в резиновых одноразовых перчатках;
- пипетировать с помощью резиновой груши с силиконовой трубкой;
- все сточные растворы, пробы, реагенты биологического происхождения следует обрабатывать в соответствии с СП 1.3.3118-13 (Раздел «Риккетсии»)
- инструменты после работы протирать 70 % этиловым спиртом или 6 % раствором перекиси водорода.
