Состав.
Вариант 1 - Набор реагентов «Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Флекснера 1-5 антигенный, жидкий».
|
Компонент |
Количество |
|
1.Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Флекснера 1-5 антигенный, жидкий |
1 флакон, 3 мл |
|
2.Сыворотка диагностическая шигеллезная Флекснера 1-5 неадсорбированная сухая |
1 флакон, лиофилизат 0,1 мл |
|
3. 1 % взвесь формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана |
1 флакон, 1 мл |
|
4. Натрия хлорида 0,9 % раствор |
2 флакона по 8 мл |
|
5. Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения |
1 шт. |
Вариант 2 - Набор реагентов «Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Зонне антигенный, жидкий».
|
Компонент |
Количество |
|
1.Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Зонне антигенный, жидкий |
1 флакон, 3 мл |
|
2.Сыворотка диагностическая шигеллезная Зонне неадсорбированная сухая |
1 флакон, лиофилизат 0,1 мл |
|
3.1 % взвесь формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана |
1 флакон, 1 мл |
|
4.Натрия хлорида 0,9 % раствор |
2 флакона по 8 мл |
|
5. Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения |
1 шт. |
В качестве анализируемых образцов используют образцы сыворотки крови человека.
Анализируемый образец хранят в условиях, предотвращающих бактериальный пророст при температуре от 2 до 8 оС не более 72 часов. Допускается замораживание, замороженные анализируемые образцы перед исследованием разморозить при комнатной температуре.
Парные сыворотки должны исследоваться одномоментно (для этого первая сыворотка до исследования должна храниться в замороженном виде).
Анализ образцов с выраженным гемолизом, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания или повторно замораживаемых не допускается.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Подготовка компонентов для РПГА.
Флакон с сывороткой диагностической шигеллезной Флекснера 1-5 неадсорбированной сухой/сывороткой диагностической шигеллезной Зонне неадсорбированной сухой вскрыть и добавить 1 мл прилагаемого 0,9 % раствора натрия хлорида, получив, таким образом, разведение 1:10. Разведение 1:100 готовить в первой лунке прилагаемого планшета: к 0,09 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавить 0,01 мл сыворотки диагностической шигеллезной, разведенной 1:10.
Сыворотку диагностическую шигеллезную (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбирован-ную сухую после вскрытия флакона в разведении 1:10 можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение одного месяца в закрытом флаконе (в вертикальном положении).
Диагностикум (диагностикум эритроцитарный шигеллезный Флекснера 1-5 антигенный, жидкий/диагностикум эритроцитарный шигеллезный Зонне антигенный, жидкий) готов к применению. Перед вскрытием флакон с диагностикумом необходимо осторожно встряхнуть до получения гомогенной суспензии. В ходе работы встряхивание рекомендуется повторять.
Вскрытый флакон с диагностикумом в закрытом виде можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение одного месяца в вертикальном положении.
1 % взвесь формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана готова к применению, перед вскрытием флакон необходимо осторожно встряхнуть до получения гомогенной суспензии. В ходе работы встряхивание рекомендуется повторять.
Вскрытый флакон с 1 % взвесью формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана в закрытом виде можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение одного месяца в вертикальном положении.
0,9 % раствор натрия хлорида готов к применению.
Проведение РПГА.
При контроле любого количества анализируемых сывороток обязательна постановка 1 ряда агглютинации с сывороткой диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой.
Для постановки РПГА используют планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения.
Готовят двукратные серийные разведения анализируемых сывороток в 0,05 мл прилагаемого 0,9 % раствора натрия хлорида, начиная с 1:10 до 1:2560, и 1 ряд двукратного серийного разведения сыворотки диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой, начиная с разведения 1:100, до удвоенного титра, указанного на этикетке флакона.
В каждую из лунок с разведениями сывороток прибавляют по 0,025 мл диагностикума.
Обязательными контролями являются:
1. Контроль сыворотки диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой в разведении 1:100; контроль анализируемой сыворотки в разведении 1:10, для чего в 2 лунки вносят по 0,05 мл каждой из сывороток.
2. Проверка отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума, для чего в 2 лунки, содержащие 0,05 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, добавляют по 0,025 мл диагностикума;
3. Контроль на отсутствие в анализируемых сыворотках агглютининов к эритроцитам барана, для чего в 2 лунки вносят по 0,05 мл анализируемой сыворотки в разведении 1:10 и добавляют по 0,025 мл 1 % взвеси формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана (контрольные эритроциты).
Планшеты осторожно встряхивают и помещают на 2-2,5 часа в термостат при температуре (37 + 1) оС, после чего производят учет результатов.
РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учет реакции производится по четырехкрестной системе:
(4+) - все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки;
(3+) - агглютинированы почти все эритроциты. На их фоне имеется малозаметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;
(2+) - наряду с равномерным агглютинатом на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов в виде кольца;
(1+) - большинство эритроцитов неагглютинировано и осело в виде маленького «колечка» в центре дна лунки;
(-) – признаков агглютинации нет, эритроциты осели в центре дна лунки в виде «пуговки».
Примечание
В первых лунках планшета может наблюдаться «феномен» сползания агглютинированных эритроцитов с образованием по краю лунки кольца с неровным краем (эффект «свертывания зонтика»).
Положительной считается реакция не менее чем на 3+.
Титром антител считается последнее разведение сыворотки, которое дает положительную агглютинацию эритроцитов.
Результаты, полученные в РПГА можно считать достоверными в том случае, если с сывороткой диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой получен положительный результат в разведении не ниже чем ½ ее титра, и в 2 лунках с анализируемой сывороткой в разведении 1:10, и с сывороткой диагностической шигеллез-ной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой в разведении 1:100 нет хлопьев и осадка; в лунках с 0,9% раствором натрия хлорида и диагностикумом, а также с формалини-зированными, несенсибилизированными эритроцитами барана и анализируемой сывороткой – реакция отрицательная.
Интерпретация результатов. Диагностически достоверным является увеличение (или падение) титров специфических антител на три разведения при исследовании парных сывороток в динамике заболевания.
Потенциальный риск применения набора – класс 2 б.
Медицинское изделие набор реагентов является безопасным при транспортировании, хранении и применении и не приносит вреда окружающей природной среде и здоровью человека. Входящие в состав изделия сыворотка диагностическая шигеллезная Флекснера 1-5 не-адсорбированная сухая или сыворотка диагностическая шигеллезная Зонне неадсорбированная сухая инактивированы. Исследуемые материалы, а также их растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ним в контакте, представляют собой потенциально инфекционный материал, при работе с которым необходимо соблюдать правила техники безопасности в соответствии с:
- ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности»;
- СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (для бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и лечебно-профилактических учреждений);
- СП 1.3.2518-09 «Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней;
- СП 1.3.2885-11 «Дополнения и изменения № 2 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Анализируемые сыворотки должны быть инактивированы в течение 30 минут при тем-пературе 56 оС.
Оборудование и материалы, находящиеся в контакте с исследуемыми образцами также представляют собой потенциально инфекционный материал, и обращаться с ними следует осторожно.
Необходимо:
- работать в боксированных помещениях для проведения микробиологических иссле-дований с применением индивидуальных средств защиты (защитной одежды и одноразовых резиновых перчаток);
- не пипетировать ртом;
- при попадании на кожу или слизистые оболочки компонентов набора место контакта необходимо промыть большим количеством воды;
- в случае пролива образцов и рабочих растворов на рабочие поверхности, необходимо проводить дезинфекционную обработку с использованием дезинфицирующих средств, эф-фективность которых подтверждена в отношении используемого в работе возбудителя;
- инструменты и оборудование (до и после работы) подвергать обработке с использова-нием дезинфицирующих средств, эффективность которых подтверждена в отношении ис-пользуемого в работе возбудителя;
- утилизировать все использованные материалы, а также их растворы, исследуемые об-разцы и их растворы в соответствии с действующими санитарными правилами работы с па-тогенными микроорганизмами.