Описание
Предназначен для качественного определения типа легких цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови и свободных легких цепей (белков Бенс-Джонса) в моче человека методами иммуноэлектрофореза (ИЭФ), преципитации в геле и для определения их соотношения в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле.
Форма выпуска
1 ампула (флакон), 1 мл.
Состав
Набор состоит из 2 компонентов:
Сыворотка против κ-цепей иммуноглобулинов человека. Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. 1 ампула (флакон), 1 мл.
Сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов человека Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. 1 ампула (флакон), 1 мл.
Показания для применения
Набор реагентов Моно-РИД-каппа, лямбда Сыворотки диагностические моноспецифические против κ (каппа) и λ (лямбда) цепей иммуноглобулинов человека сухие предназначен для качественного определения типа легких цепей иммуноглобулинов в сыворотке крови и свободных легких цепей (белков Бенс-Джонса) в моче человека методами иммуноэлектрофореза (ИЭФ), преципитации в геле и для определения их соотношения в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле.
Способ применения
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ).
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с моноспецифическими сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90 ± 120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора нормальной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенные моноспецифические сыворотки против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.
Учет результатов проводить визуально. Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б.
Типирование белков Бенс-Джонса проводить в ИЭФ с сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов: с одной сывороткой образуется четкая линия преципитации, а с другой сывороткой линии преципитации не образуются.
Иммуноглобулинов, б – сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов, в – сыворотка против IgG(H).
При не выявлении линий преципитации миеломной конфигурации с сыворотками против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) рекомендуется провести в образцах количественное определение IgD и IgE.
Реакция преципитации в геле (по Оухтерлони).
Приготовление агарового геля 1 %.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 100 мл воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлорида, 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90 ± 120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания на агаре с помощью специального штампа вырезать лунки и удалить из них агар.
В центральную лунку внести с помощью пипеточного дозатора растворенную моноспецифическую сыворотку, а в лунки, расположенные по окружности – анализируемые образцы (моча миеломных больных, растворы, выделенных из нее белков Бенс-Джонса).
После внесения образцов пластины поместить во влажную камеру и выдержать при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле между лунками при наличии соответствующих антигенов и антител образуются линии преципитации.
Если анализируемый образец образует линию преципитации с сывороткой против κ-цепи и не образует ее с сывороткой против λ-цепи, то в ней присутствует белок Бенс-Джонса κ-типа. При противоположном результате – в анализируемом образце присутствует белок Бенс-Джонса λ-типа.
Радиальная иммунодиффузия (РИД) (по Манчини).
Принцип метода заключается в том, что антиген, внесенный в лунки агарового геля, содержащего моноспецифическую сыворотку к этому антигену, диффундирует в гель и, взаимодействуя с антителами сыворотки, образует кольцо преципитации. После инкубации устанавливается линейная зависимость между логарифмом концентрации антигена и диаметром кольца преципитации в определенном диапазоне концентраций.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерный стакан на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.
Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 2 %.
2 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и затем варить на кипящей водяной бане в 0,1 л воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлористого, затем 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Агаровый гель разлить в пробирки по 6-8 мл, три из которых поставить в водяную баню с температурой (53±3) °С.
Приготовить последовательные разведения контрольной сыворотки крови человека натрия хлорида раствором 0,9 % в 2 и 4 раза.
На обезжиренную стеклянную пластину, покрытую тонкой агаровой пленкой, поместить П-образную рамку, накрыть второй пластиной, смазанной гидрофобной жидкостью, и скрепить зажимами.
Растворенные моноспецифические сыворотки развести натрия хлорида раствором 0,9 % до концентрации, в два раза превышающий титр, указанный на ампуле (например, при указанном титре 1 : 10 сыворотку следует развести в 5 раз), чтобы потом при смешивании в равных количествах с растопленным агаровым гелем получилось заявленное разведение.
Пробирки с разведенными сыворотками промаркировать и поставить для прогрева в водяную баню с температурой (53±3) °С в течение 20-30 мин.
Агаровый гель 2 % тщательно смешать с равным объемом разведенной моноспецифической сыворотки. Полученную смесь с помощью стеклянной пипетки залить в пространство между стеклянными пластинами. Пластины промаркировать по содержащейся в агаре сыворотке и поместить на 15-20 мин.
Таким образом приготовить пластину и для второй сыворотки.
После застывания агара снять зажимы, верхнее стекло и рамку. В слое агара прорезать пробойником несколько рядов лунок диаметром 2-3 мм на расстоянии 15 мм от другого и агар из них удалить.
С помощью микрошприца внести в лунки по 2 мкл нормальную сыворотку крови человека (неразведенную и в разведениях в 2 и 4 раза) и анализируемые образцы.
Затем пластины поместить во влажную камеру и инкубировать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Меры предосторожности при применении
Все компоненты набора нетоксичны. Исследуемые образцы могут быть потенциально опасны. При работе следует использовать средства индивидуальной защиты, а образцы и использованные материалы после проведения анализа обеззараживать раствором перекиси водорода 6 % или раствором хлорамина Б 3 % в течение 2 ч.
