Способ применения
Анализируемые образцы следует хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 7 сут или при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Замороженные образцы перед исследованием следует разморозить и тщательно перемешать путем встряхивания. Повторное замораживание не допускается.
ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
Оборудование: прибор для иммуноэлектрофореза с выпрямителем электрического тока, весы аналитические, плитка электрическая, рН-метр, холодильник, предметный столик с регулируемым уровнем, пластины стеклянные (90 × 120) мм, влажная камера, мерная посуда, дозаторы пипеточные со сменными наконечниками, контейнер для обеззараживания.
Реагенты и материалы:
– агар;
– амидо черный 10Б;
– веронал;
– вода очищенная;
– глицерин;
– кислота борная;
– кислота уксусная;
– мединал;
– мертиолят (тимерозал);
– натрий тетраборнокислый 10-водный;
– натрия хлорид;
– пиронин Б;
– бумага фильтровальная лабораторная;
– перчатки одноразовые;
– дезинфицирующие растворы.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Иммуноэлектрофорез.
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с сывороткой для ИЭФ и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерную колбу на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.
Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90±120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.
Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора растворенной контрольной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенную сыворотку для ИЭФ. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 48 ч.
После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.
Окрашивание агара.
Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку.
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить.
Учет результатов.
Учет результатов проводить визуально.
