Тест-система иммуноферментная для определения аллергенспецифических IgE-антител человека «IgE-АТ-ИФТС»

Описание

Аллергодиагностические тест-системы используются в комплексе спец-ифической диагностики аллергических заболеваний (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит и т. д.). Тест-система иммуноферментная для определения аллергенспецифических IgE-антител человека «IgE-АтТ-ИФТС».

Форма выпуска

Форма выпуска - набор из 8 реагентов с инструкцией по применению и бланками "Протокол опыта" (3 экз.) в коробке из картона, паспорт в комплекте поставки.

Назначение

Изделие для диагностики ин витро Набор реагентов «IgE-АТ-ИФТС» предназначен для полуколичественного определения аллергенспецифических IgE-антител в сыворотке крови пациентов при диагностике аллергических заболеваний различной этиологии.

Набор реагентов позволяет выявлять в сыворотке крови пациентов аллергенспецифические IgE-антитела к аллергенам 173 наименований в диапазоне, характеризующим 4 класса (уровня) этих антител. Каждый набор рассчитан на поведение тестов к 30 наименованиям аллергенов (по выбору потребителя) по 8 определений к каждому виду. 

Функциональное назначение - вспомогательное средство в диагностике.

Область применения – клиническая аллергология.

Ремонту и техническому обслуживанию не подлежит.

Характеристика изделия

Набор реагентов позволяет выявлять в сыворотке крови пациентов аллергенспецифические IgE-антитела к аллергенам 173 наименований в диапазоне, характеризующим 4 класса (уровня) этих антител. Каждый набор рассчитан на поведение тестов к 30 наименованиям аллергенов (по выбору потребителя) по 8 определений к каждому виду.

Принцип метода

В основе метода лежит принцип двухступенчатого твердофазного иммуноферментного анализа. После внесения образцов аллергены, сорбированные на планшетах, образуют комплексы антиген - антитело с аллергенспецифическими IgE-антителами соответствующего вида, содержащимися в референс - реагенте Р₃ и образцах сывороток крови больных, с последующим взаимодействием IgE-антител этого комплекса с моноклональными анти-IgE-антителами, входящими в состав пероксидазного конъюгата.

Не связавшиеся компоненты анализируемой пробы и избыток конъюгата отмываются, а активность фермента в составе иммунных комплексов определяется с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окраски хромогена прямо пропорциональна содержанию IgЕ-антител в образце. Результаты анализа регистрируются фотометрически с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 492 нм.

Состав набора

Компоненты	Описание	Количество
Реагент 1 (Р1)	Аллергены, сорбированные в концентрации от 1 до 40 мкг/мл белка в лунках на стрипах полистироловых 96-луночных планшетов наборных для ИФА без следов жидкости, осадка, включений. Номенклатура стрипов с сорбированными аллергенами по выбору из 173 наименований (см. приложение № 1) в любом сочетании.	30 стрипов (рядов) по 10 стрипов (рядов) на 3-х планшетах
Референс-реагент 2 (Р2)	Аллерген из пыльцы амброзии, сорбированный в концентрации 40±2 мкг/мл белка на стрипах полистироловых 96-луночных планшетов наборных для ИФА без следов жидкости, осадка и включений.	6 стрипов (рядов) по 2 стрипа (ряда) на 3-х планшетах
Референс-реагент 3 (Р3)	Сыворотка крови больных амброзийным поллинозом, имеющая уровень специфических IgE-антител, соответствующий 4 классу (7-16,99 МЕ/мл). Опалесцирующая жидкость светло-желтого цвета, возможно присутствие взвеси фибриновых частиц.	1,0 мл во флаконе
Реагент 4 (Р4)	Конъюгат мышиных моноклональных антител к иммуноглобулину Е человека с пероксидазой, рабочий титр 1:100. Прозрачная жидкость.	0, 6 мл во флаконе
Реагент 5 (Р5)	Разводящий и промывающий раствор, концентрированный, содержащий натрий хлористый в концентрации 1,5 моль/л, твин-20 объемной долей 0,5 % и натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный в концентрации до рН 7,2-7,4. Прозрачная бесцветная или светло-желтая жидкость (возможно выпадение кристаллов соли).	90 мл во флаконе
Реагент 6 (Р6)	Цитратный буферный раствор концентрированный, содержащий кислоту лимонную в концентрации 1 моль/л и натрий лимоннокислый в концентрации 1 моль/л, pH от 4,5 до 4,9, с содержанием перекиси водорода 0,05 %. Прозрачная бесцветная жидкость (возможно выпадение кристаллов солей).	3,7 мл во флаконе
Реагент 7 (Р7)	Хромоген ортофенилендиамин (ОФД). Таблетки светло-желтого или бежевого цвета.	3 таблетки по 0,005 г или 0,01 г во флаконе
Реагент 8 (Р8)	Раствор кислоты серной с массовой долей 50 %. Прозрачная бесцветная жидкость.	20 мл во флаконе

Меры предосторожности при работе с изделием

Класс потенциального риска применения – 2а.

Входящая в состав Набора Референс-сыворотка тестирована на отсутствие маркеров к ВИЧ-инфекции и вирусным гепатитам. Однако исследуемые сыворотки и плазма крови людей, а также сточные растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ними в контакте, представляют собой потенциально инфицированный материал и требуют осторожного обращения.

При работе необходимо соблюдать правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (для бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и лечебно-профилактических учреждений):

• при работе следует использовать резиновые одноразовые перчатки, для розлива жидкостей – дозаторы с одноразовыми пластиковыми наконечниками;
• не пипетировать ртом;
• оборудование, находящееся в контакте с биологическими образцами и реагентами, следует дезинфицировать до и после работы с использованием 70% этилового спирта.
• все сточные растворы следует обрабатывать 6 % раствором перекиси водорода в течение 3 часов
• все компоненты Набора (за исключением ортофенилендиамина) являются нетоксичными.
• ортофенилендиамин может оказывать токсическое действие при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании. Следует избегать любого контакта и попадания внутрь. При попадании на кожу или слизистые покровы необходимо место контакта смыть большим количеством воды.
• реагенты не должны соприкасаться с окисляющими веществами и солями тяжелых металлов
• серная кислота (Р8) при попадании на кожу и слизистые может вызвать раздражение и ожоги. Обращаться с осторожностью, при попадании на кожу обильно промыть водой с добавлением пищевой соды.

Утилизация изделий, пришедших в негодность, с истекшим сроком годности и изделий после контакта с биологическими образцами осуществляется в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

Способ применения

Оборудование и реагенты

• многоканальный спектрофотометр вертикального сканирования;
• термостат на 37 °С;
• шейкер;
• дозаторы (пипетки) автоматические 1 канальные - от 10 до 200 мкл и 8- канальные от 50 до 200 мкл;
• наконечники полипропиленовые на 100-1000 мкл;
• стаканы, колбы химические мерные вместимостью 50-1000 мл;
• цилиндры мерные вместимостью 50—1000 мл;
• пробирки стеклянные;
• перчатки резиновые хирургические;
• вода очищенная;
• спирт этиловый 70 %;
• 6 % раствор перекиси водорода (для обеззараживания).

Анализируемые пробы

Исследуемые пробы крови собирают в сухие пробирки, после отделения сыворотку используют для анализа. Минимальный объем исследуемого образца для одной пробы – 0,1 мл. Если тестирование проводится не сразу, то сыворотки можно хранить при температуре минус 18-20 °С в течение 6 мес. Замороженные образцы перед исследованием разморозить при комнатной температуре. Повторное замораживание не допускается. Исследование образцов с выраженным гемолизом, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания не допускается. 

Подготовка реагентов для анализа

1. Перед постановкой ИФА извлечь набор из холодильника и выдержать его при комнатной температуре не менее 30 мин. Перед разведением жидкие реагенты тщательно перемешать встряхиванием. Планшеты освободить от упаковки.
2. Используемые сыворотки больных распределить для соответствующего анализа, заполнить схему расположения образцов в прилагаемых протоколах опыта.
3. Приготовить следующие рабочие растворы, как указано в таблице:

Рабочие растворы	Приготовление	Хранение
№1 – разводящий и промывающий раствор	30 мл Р5 довести до 300 мл очищенной водой, рН раствора от 7,2 до 7,4 (на один планшет).	Хранить при комнатной температуре 7 дней
№2 – рабочий раствор конъюгата	0,2 мл Р4 довести до объема 20 мл раствором №1 (на 1 планшет)	Использовать в день приготовления
№3 – рабочий раствор хромогенного субстрата	В защищенном от света месте 1 таблетку Р7 растворить в 18,8 мл очищенной воды, добавить 1,2 мл Р6 (на 1 планшет). Раствор должен быть бесцветным.	Готовить непосредственно перед употреблением
№ 4 – растворы референс-реагента Р3 раствор Р3А	Р3 - цельный	Хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 1 суток
раствор Р3В	К 0,2 мл раствора Р3А добавить 0,8 мл раствора № 1
раствор Р3С	К 0,05 мл раствора Р3А добавить 0,95 мл раствора № 1
раствор Р3Д	К 0,1 мл раствора Р3В добавить 0,9 мл раствора № 1

Проведение анализа

1. Время внесения образцов и инкубации должны быть одинаковыми для всех лунок в одном планшете.
2. Раствор конъюгата № 2, раствор хромогенного субстрата № 3 и останавливающий реагент Р₈ вносить в лунки по рядам в той же последовательности, что и пробы. Использовать многоканальные полуавтоматические пипетки.
3. Пробы вносить в соответствии со схемой расположения образцов, представленной в бланках "Протокол опыта".
4. В каждую лунку 1 ряда (А-Н) внести по 0,2 мл раствора №1. Во все лунки последующих рядов внести по 0,1 мл раствора №1.
5. В лунки А и В 2-го ряда внести по 0,1 мл раствора Р₃А, в лунки С и Д по 0,1 мл раствора Р₃В, в лунки Е и F – по 0,1 мл раствора Р₃С, в лунки G и H – по 0,1 мл раствора Р₃Д. Все растворы реагента Р₃А – Р₃Д являются положительными контрольными пробами тест-системы.
6. Во все лунки последующих рядов внести по 0,1 мл исследуемых сывороток, слегка перемешать на шейкере или покачиванием планшета.
7. Планшет закрыть крышкой и поместить в термостат при температуре от 36 до 38 °C на 1 час для образования комплекса антиген-антитело.
8. По истечении времени инкубации жидкость из лунок удалить вытряхиванием и в каждую лунку многоканальной пипеткой внести по 0,2 мл раствора №1 на 2-3 мин, после чего жидкость вновь удалить. Процедуру повторить не менее 3-х раз. По окончании отмывки планшет осушить на фильтровальной бумаге.
9. В каждую лунку планшета внести по 0,2 мл рабочего раствора №2. Планшеты закрыть крышкой и поместить в термостат при температуре от 36 до 38 °C на 1 час.
10. Отмывку планшета проводить, как описано в пункте 8.8., повторив процедуру не менее 5-ти раз.
11. Во все лунки планшета внести по 0,2 мл свежеприготовленного раствора № 3. Выдержать в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. В лунках, где прошла реакция, появится желтое окрашивание разной степени интенсивности. Лунки первого ряда (отрицательная контрольная проба) должны оставаться неокрашенными.
12. Остановить реакцию добавлением во все лунки по 0,05 мл Р₈, перемешивая в течение 1 мин.

Учет результатов

Учет провести инструментально на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 492 нм.

Анализ считается действительным, если показатели оптической плотности (ОП), выраженные в оптических единицах (ОЕ), соответствуют следующим значениям:

ОП лунок с максимальной концентрацией Р₃ (раствор Р₃А без разведения) – от 1,0 до 2,6 ОЕ;

Соотношения ОП стандартных разведений Р₃ (растворов Р₃А, Р₃В, Р₃С, Р₃Д) следующие:

ОП Р₃А>ОП Р₃В>ОП Р₃С>ОП Р₃Д

ОП лунок с контролем конъюгата меньше 0,15 ОЕ.

Интерпретация результатов

Рассчитать среднюю арифметическую ОП дублей растворов Р₃А, Р₃В, Р₃С, Р₃Д и образцов тестируемых сывороток. ОП исследуемых сывороток соотнести с диагностическими интервалами ОП растворов Р₃ 

Диагностические интервалы ОП растворов Р3	Степень реакции (класс)	Уровень IgЕ-антител
ОП Р3А и выше	4	очень высокий (7 МЕ/мл - 16,99 МЕ/мл)
ОП Р3А- Р3В	3	высокий (3 МЕ/мл - 6,99 МЕ/мл)
ОП Р3В- Р3С	2	умеренный (1 МЕ/мл - 2,99 МЕ/мл)
ОП Р3С- Р3Д	1	низкий (0,35 МЕ/мл - 0,99 МЕ/мл)
ОП Р3Д и ниже	0	Отрицательный

По полученным результатам заполнить форму "Протокол опыта".

Условия хранения и эксплуатации

Хранение в течение всего срока годности в сухом защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 ºС. Замораживание не допускается!

Транспортирование при температуре от 2 до 8 ºС. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 ºС не более 48 ч. Замораживание не допускается!

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей Инструкции по применению.